论文摘要：从公共数据库中下载61, 731条草莓表达序列标签（EST），组装后得到系列非冗余EST 14, 948条，总长度为9, 969.35 kb，挖掘到1, 807个SSR，分布在1, 515条序列上，发生频率为10.14%，平均每5.52 kb出现1个SSR。其中，235条系列包含2个或2个以上SSR，76个SSR以复合形式出现。二核苷酸（794个SSR）和三核苷酸（795个SSR）是主要的类型，所占比例分别为43.94%和44.00%。AG/CT（691个）和 AAG/CTT（278个）在二、三核苷酸中占主导地位。利用这些序列，设计47对引物，对生产上主栽的3个日本品种进行多态性研究，44对引物有扩增产物，6对表现多态性。结果表明，从草莓相关EST数据库中开发的EST-SSR引物可行且有用，在草莓品种鉴定、种质资源分析、遗传作图等研究方面有广阔的应用前景。

　　论文关键词：草莓，标记开发

　　简单序列重复简称SSR，是一类由几个（多为1-6个）碱基为单位串联重复的DNA序列，表达序列标签简称EST，是来源于一定环境（正常生长或逆境胁迫等）一定组织（根、茎、叶、花、果等）一定长度（20-700bp不等）的cDNA片段，EST-SSR标记是近年来新发展的来自于比较保守的转录区的SSR标记。与普通SSR标记相比，它是功能基因的序列，高质量标记的比率较多；开发过程简单成本低；是一种有功能的分子标记。

　　随着大规模基因组测序的发展，公共序列数据库中集中了大量可用的EST序列，从公共数据库获得EST序列开发EST-SSR标记是一种非常快速、高效的方法。这种方法已经被越来越多的果树研究者用来开发EST-SSR标记，并在遗传多样性、亲缘关系、功能基因定位、遗传作图中得到应用。目前，已发表的草莓属SSR标记数目约250个，这些标记来源于基因组文库，GenBank序列。草莓相对于其他果树甚至蔷薇科果树开发并发表的SSR标记数目较少，有必要开发大量的SSR标记，尤其是功能性EST-SSR标记，以丰富草莓SSR标记数目，为草莓基因组学研究及育种提供帮助。

　　本研究从公共数据库中下载草莓EST序列，去冗余处理后，用SSR搜索工具对这些序列进行搜索，对搜索到的包含SSR的EST序列用PrimerPremier5.0设计引物，并用3个主栽草莓品种检测新开发的SSR标记，确定引物的多态性和有用性，为今后开发EST-SSR标记提供参考。

　　1材料和方法

　　1.1草莓EST序列来源

　　草莓EST来自NCBI（美国国家生物技术信息中心）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）、PlantGDB（http://www.plantgdb.org/）、和http://www.bioinfo.wsu.edu/cgi-bin/gdr/gdr_unigeneV4_project_description.cgi?genus=fragaria三个网站的EST，共计61,731条。

　　1.2EST-SSR挖掘

　　首先，用SeqClean（http://www.tigr.org/tdb/tgi/software）去除载体、线粒体叶绿体等序列及冗余，然后用EST-trimmer（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/download/est_trimmer.pl）除去5’端或3’端50bp的polyT或polyA，并剔除小于100bpESTs。前处理后的EST通过软件Phrap进行片段重叠群分析和聚类。拼接时设定的初始装配参数为：最小匹配碱基数（minmatch）为20,最小分值（minscore）为40。对错误拼接序列设置比较高的装配参数再次进行拼接、判别，共进行了3次。用SSRIT（http://gramene.agrinome.org/db/searches/ssrtool）检索SSR-EST。筛选标准为：单核苷酸重复的次数在16次或16次以上，二核苷酸重复的次数在6次或6次以上，三至六核苷酸重复的次数在5次或5次以上。同时，也筛选中间被少数碱基（间隔小于10或等于10）打断的不完全重复的SSR。

　　1.3EST-SSR引物设计

　　利用PrimerPremier5.0软件设计SSR位点两侧引物。参数设置如下：产物长度范围设为75-350bp，引物长度范围为18-27bp，最佳为20bp。其它参数采用默认值。引物设计时确保产物序列中包括SSR位点。选用软件给出的最优的设计结果合成引物，引物由上海invitrogen设计。

　　1.4DNA提取、PCR扩增及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　试验材料生产上主栽的日本品种：红颊、明宝，佐贺清香。DNA提取采用CTAB法（陆苏瑀等，2010）。PCR反应体系为25μL，其中包括：1×Buffer，1.5mmol·LMgCl200mmol·LdNTPs，0.3mmol·L引物，0.5UTaq酶，50ngDNA模板，所用试剂均购自Fermentas公司。PCR扩增反应条件是：94℃预变性4min；94℃30s，合适温度退火45s，72℃延伸1min，30-35个循环；72℃延伸5min。PCR产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在Bio-Rad序列分析电泳槽电泳，75W，1-1.5h。银染法染色（陆苏瑀等，2010）。

　　2结果与分析

　　2.1草莓EST-SSR出现的频率和特点

　　从NCBI等公共数据库下载61,731条草莓EST，检测的系列非冗余EST14,948条，总长度为9,969.35kb，挖掘到1,807个SSR，分布在1,515条序列上，发生频率（检出的SSR的EST数目与EST数目之比值）为10.14%，平均每5.52kb出现1个SSR。（表1）。从表1可知，草莓EST-SSR种类丰富，一至六核苷酸重复类型都能被检出，但各类型的SSR出现频率迥异。单、二、三核苷酸重复基元明显高于四、五、六核苷酸类型，前三者分别占SSR总数的10.90%、43.94%、44.00%，而后三者均不足1.00%。二核苷酸和三核苷酸重复的出现频率相近，数量最多。而数目越多的重复基元出现的平均距离越小。

　　表1草莓EST中SSR出现频率

　　Table1OccurrenceofSSRsinstrawberryESTs

　　重复类型

　　Repeat type classes

　　SSR数目

　　Number of SSRs

　　百分比

　　Percentage （%）

　　平均距离/kb

　　Mean distance

　　单核苷酸Mononucleotide

　　197

　　10.90

　　50.61

　　二核苷酸Dinucleotide

　　794

　　43.94

　　12.56

　　三核苷酸Trinucleotide

　　795

　　44.00

　　12.54

　　四核苷酸Tetranucleotide

　　16

　　0.89

　　623.08

　　五核苷酸Pentanucleotide

　　六核苷酸Hexanucleotide

　　合计Total

　　4

　　1

　　1807

　　0.22

　　0.05

　　100

　　2492.34

　　9969.35

　　5.52

　　表2不同重复基元类型的EST-SSR分布频率

　　Table2FrequencyofclassifiedrepeattypesinEST-SSR

　　重复类型

　　Repeat type classes

　　重复基元

　　Repeat motifs

　　数目

　　Numbers

　　百分比

　　Percentage （%）

　　单核苷酸

　　Mononucleotide

　　A/T

　　C/G

　　184

　　13

　　10.18

　　0.72

　　二核苷酸

　　Dinucleotide

　　AC/GT

　　AG/CT

　　AT/AT

　　CG/CG

　　41

　　691

　　61

　　1

　　2.27

　　38.24

　　3.38

　　0.06

　　三核苷酸

　　Trinucleotide

　　AAC/GTT

　　AAG/CTT

　　AAT/ATT

　　ACC/GGT

　　ACG/CTG

　　ACT/ATG

　　AGC/CGT

　　AGG/CCT

　　AGT/ATC

　　CCG/CGG

　　59

　　278

　　14

　　82

　　38

　　40

　　63

　　141

　　24

　　56

　　3.27

　　15.38

　　0.77

　　4.54

　　2.10

　　2.21

　　3.49

　　7.80

　　1.33

　　3.10

　　各种主要SSR类型如表2所示，各种不同重复基元出现频率存在很大差异，取百分比高于1%的核苷酸重复基元分析，结果表明A/T在单核苷酸中占了极大份额（10.18%），AG/CT在二核苷酸重复类型中出现频率最高（38.24%），而AAG/CTT是三核苷酸重复类型中的优势基元（15.38%）。二核苷酸重复基元有四种，除AG/CT外，AC/GT、AT/AT比例相关不大，远高于CG/CG。三核苷酸重复基元有十种，AGG/CCT、ACC/GGT、AGC/CGT、AAC/GTT、ACT/ATG、ACG/CTG出现频率分别为7.80%、4.54%、3.49%、3.27%、2.21%、2.20%，AGT/ATC、AAT/ATT出现频率较低。

　　对于基元重复长度，二核苷酸跨度最大，从12-130bp，三核苷酸跨度小于二核苷酸，从15-42bp；对于平均长度，五核苷酸最大为31.25bp,而三核苷酸最小为17.46bp（表3）。2.2草莓EST-SSR引物设计及其有效性

　　利用Primer5对235条系列进行SSR引物设计，共设计47对（代号JAAS1-47）引物。用这47对标记扩增生产上主栽的遗传差异较小的三个日本草莓品种红颊、明宝，佐贺清香，以检测引物的扩增成功率以及多态性。结果表明，44对引物能成功扩增，6对引物表现多态性（表3），引物的有效扩增率达93.62%，多态性占12.77%，说明利用草莓EST序列开发EST-SSR标记是可行的，并能有效的用于草莓品种的鉴定。

　　表3基元类型的重复长度分布

　　Table3Distributionofrepeattypeclassesbasedonsize

　　重复类型

　　Repeat type classes

　　跨度（bp）

　　Range

　　平均长度

　　Average size

　　二核苷酸Dinucleotide

　　12-130

　　19.87

　　三核苷酸Trinucleotide

　　15-42

　　17.46

　　四核苷酸Tetranucleotide

　　五核苷酸Pentanucleotide

　　六核苷酸Hexanucleotide

　　20-36

　　25-40

　　30

　　22.40

　　31.25

　　30

　　表4草莓6对多态性EST-SSR引物信息

　　Table46primerpairsfromstrawberry

　　引物

　　Primer

　　基元

　　Motif

　　Tm

　　℃

　　引物序列

　　Primer Sequences

　　扩增长度

　　bp

　　JAAS3

　　（AG）

　　62

　　F-CGAGGTCCCGATGTCGTTGT

　　R-TGATGCTGGCGTTGATGGTT

　　135

　　JAAS7

　　（CAC）

　　62

　　F-AGCAGCAACATTTCCAGACA

　　R- TCGGGCCTTAACTTCCTCTA

　　115

　　JAAS11

　　（CT）

　　59

　　F-TATTCAACCCTCTACCACCA

　　R-CAACAATCAAAGCTATAAGA

　　180

　　JAAS13

　　（AAG）

　　61

　　F-TGCCCTACTTTCACTTTCCT

　　R-CATACGCAGCGACATCTTCT

　　85

　　JAAS38

　　JAAS44

　　（CCA）

　　（TC）

　　61

　　60

　　F-AAGAGCTTTGCGTTTTCCTC

　　R-CACTATGTCGGCTTTGAACC

　　F-TTTTACAGACTGCTACAGAG

　　R-AGATGAAGAAGATGGAGAAG

　　230

　　280

　　M：分子量marker；1-3：日本草莓品种（1：明宝，2：佐贺清香，3：红颊）；引物：JAAS1-15

　　M:marker;1-3:Japanesestrawberrycultivar（1:Meiho,2:Sagahonoka,3:Benihoppe）；primer:JAAS1-15

　　图1不同EST-SSR引物在不同日本品种中的扩增结果

　　Fig.1TheamplificationresultsofdifferentEST-SSRprimerindifferentJapanesecultivar

　　前人研究表明，不同物种占优势的EST-SSR重复类型有所差异。在葡萄、柑橘中以三核苷酸重复为主，而在猕猴桃、核桃、杏和桃等中则是二核苷酸重复最多。本研究中，草莓EST-SSR序列中，二核苷酸重复和三核苷酸重复出现频率最高，三核苷酸稍高二核苷酸，二核苷酸重复中以AG/CT占主导，这与蔷薇科植物分布相同，证实了Gupta的观点，但与Powell认为的植物中主要二核苷酸重复是AT/AT相异。AG/CT根据读码框不同可以代表不同密码子如UCU、CUC、GAG、AGA，它们被翻译成甘氨酸、亮氨酸、精氨酸、谷氨酸，而甘氨酸、亮氨酸在草莓等蔷薇科植物中使用频率较高，因此AG/CT在二核苷酸重复中占绝对优势；本研究三核苷酸重复以AAG/TTC重复为主，是植物EST中三核苷酸重复的主要SSR类型。

　　对含有SSR位点的EST序列设计引物并分析其扩增效率、检验其多态性是标记开发的关键。已有研究表明成功扩增比例最高的是苹果100%，最低的是葡萄62.5%，本研究中设计引物的有效扩增率93.62%，介于两者之间。由于扩增的模板是基因组DNA，因此成功扩增不仅与EST序列质量、引物设计相关，而且与扩增区是否含有内含子显著相关。在标记的多态性比例上本研究为12.77%，导致EST多态性低的原因是由于EST序列的保守性[21]和多态性检验材料的遗传上高度相似性。EST不同区域的引物在不同属间、种间和品种间有不同水平的差异性，5’端和3’端非编码区的引物在品种间和种间多态性较多，尤其是3’端非编码区由于经常发生cDNA的剪切，在品种间的多态性较高，本研究所用EST多采用编码区；同时如果用来源更广、差异更大的材料用于检验，多态性可能会更多。本研究表明基于公共数据库开发的草莓EST-SSR引物是可行的，能用于草莓品种鉴定，并在草莓指纹图谱构建、种质资源分析、遗传作图等研究方面有广阔的应用前景。

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